药典2020版准则3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(淋巴细胞毒试验)

3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(淋巴细胞毒试验)

本法系依据抗人T细胞免疫球蛋白与人淋巴细胞结合,在补体存在下破坏淋巴细胞,根据淋巴细胞死亡率测定供试品抗人T细胞免疫球蛋白效价。

试剂 (1)淋巴细胞分离液(Ficol's液)

(2)Hank's液。

(3)20%胎牛血清Hanks液 试验当天取适量经消毒保存的Hank's液,加入经56℃、30分钟灭能的胎牛血清,配成20%浓度。用0.5mol/碳酸氢钠溶液或稀盐酸调pH值至7.2~7.4。

(4)淋巴细胞悬液 取肝嘉抗凝新鲜人静脉血加等量0.85%~0.90%氨化钠溶液混匀后,缓慢加至等量淋巴细胞分离波液面上,以每分钟2000转离心20分钟，吸出淋巴细胞层细胞，加话是0.85%~090%氧化颖溶波清洗，以每分钟1200转离心10分钟，在上清波，沉淀加入话是20%胎生血清Hank'液，摇匀，为淋巴细胞原液:用1%醋酸蓝液将淋巴细胞原液稀释20倍,镜检计数淋巴细胞。根据计数结果,用20%胎牛血清Hank's液将淋巴细胞原液稀释成每1ml含5x10⁶个淋巴细胞，即为淋巴细胞悬液。

(5)补体 采用正常家兔血清。作补体用的兔血清应对试验用的靶细胞无明显的毒性,因此家兔血清要预先进行选择,方法如下:取淋巴细胞悬液0.05ml，加1:5稀释的家兔血清0.05ml,置37℃、1小时后,加0.5%台盼蓝生理氣化钠溶液0.05ml,置37℃、5分钟后镜检计数淋巴细胞,死亡细胞率在10%以下者方可作补体用。

(6)0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液。

(7)2.5%戊二醛溶液(用Hank's液稀释)。

供试品溶液的制备根据供试品效价 用20%胎牛血清Hank's液将供试品稀释至几个适宜浓度。

阳性对照溶液的制备 将经人T淋巴细胞免疫的猪血浆或兔血清在60℃加热10分钟后,用0.85%~0.90%氨化钠溶液稀释10倍。

阴性对照溶液的制备 将正常猪血浆或兔血清在60℃加热10分钟后,用0.85%~0.90%氨化钠溶液稀释10倍。

测定法 取供试品溶液0.05ml,加淋巴细胞悬液0.05ml,置37℃、1小时,加1:5稀释的家兔血清0.05ml,置37℃、30分钟后加0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml,置37℃、5分钟,立即镜检计数淋巴细胞,计算死亡细胞率,一般数100个淋巴细胞。取阳性对照溶液0.05m1,加淋巴细胞悬液0.05ml,自"置37°℃、1小时"起,同法操作,作阳性对照。取阴性对照溶液0.05ml,加淋巴细胞悬液0.05ml,自“置37℃、1小时"起,同法操作,作阴性对照。

结果判定 阳性对照组的死亡淋巴细胞率大于20%,且阴性对照组的死亡淋巴细胞率小于10%,试验成立。以(+)为判定终点，出现(+)供试品的最高稀释度为该供试品的淋巴细胞毒效价，

【附注】(1)试验组死亡淋巴细胞率

小于10%(-)41%-60%(++)

10%~20%(±)61%~80%(+++)

21%-40%(+)不低于81%(++++)

(2)如供试品较多或来不及看结果时,为避免试验误差,可在抗原、抗体、补体作用后加0.5%台盼蓝生理氣化钠溶液0.05ml,置37°C、5分钟后立即加2.5%戊二醛溶液0.05ml,留待适当时候镜检;或先加2.5%戊二醛溶液0.05ml,室温放置10分钟后,加入0.5%台盼蓝生理氨化钠溶液0.05ml置37℃℃，5分钟后留待适当时候镜检。

来源：药典委